دانشكده علوم دامي و شيلات
رساله دكتري تخصصي ژنتيك و اصلاح نژاد دام
عنوان:
نقشه يابي فيزيکي مقايسه اي ژن هاي BMPR1B، BMP15 و GDF9 با استفاده از تکنيک FISH روي کروموزوم هاي گاو، گاوميش رودخانه اي، گوسفند و بز
اساتيد راهنما:
دكتر سيد حسن حافظيان
پروفسور قدرت اله رحيمي ميانجي
استاد مشاور:
Prof. Leopoldo Iannuzzi
نگارش:
ايوب فرهاي
شهريور 1392
کليه حقوق مادي مترتب بر نتايج مطالعات، ابتکارات و نوآوري هاي ناشي از تحقيق موضوع اين پايان نامه متعلق به دانشگاه مازندران و دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبيعي ساري است.
تشکر و قدر داني
بر خود واجب مي دانم از تمامي عزيزاني که در طول تحصيل در مقطع دکتري تخصصي اينجانب را ياري نمودند کمال تشکر و قدر داني را داشته باشم.
از اساتيد راهنماي عزيزم آقايان دکتر سيد حسن حافظيان و پروفسور قدرت اله رحيمي ميانجي که در هر دو مقطع کارشناسي ارشد و دکتري تخصصي افتخار دانشجويي ايشان را داشتم به واسطه همه تلاش ها و راهنمايي هايي که در مراحل مختلف انجام اين رساله داشتند سپاسگزاري بي نهايت را دارم.
از استاد مشاور بزرگوارم آقاي پروفسور يانوزي از موسسه پژوهش هاي ملي ايتاليا (CNR) و تيم تحقيقاتي ايشان در آزمايشگاه سيتوژنتيک و مکان يابي ژن ها کمال قدر داني را دارم. اگرچه در ابتدا اين رساله با بيم بسيار قدم در عرصه سيتوژنتيک مولکولي و مکان يابي فيزيکي ژن ها گذاشتيم، اما افتخار شاگردي در محضر دانشمند بزرگي چون ايشان هموار کننده اين مسير دشوار بود.
از تمامي اساتيد گروه علوم دامي دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبيعي ساري مخصوصاً از مدير گروه سابق دوست خوبم آقاي دکتر زربخت انصاري کمال تشکر را دارم.
از آقاي دکتر محسن قلي زاده تنها همکلاسي دوره تحصيلم در مقطع دکتري و آقاي مهندس روحي کارشناس محترم آزمايشگاه ژنتيک مولکولي و بيوتکنولوژي دام دانشکده علوم دامي و شيلات کمال سپاسگزاري را دارم.
در پايان از تمامي اعضاي خانواده ام مخصوصاً همسر و فرزند مهربانم و پدر و مادر عزيزم بي نهايت سپاسگزارم.
برگ سبزيست تحفه درويش…..
تقديم به
همسر مهربان و دختر عزيزم
چکيده
هدف اصلي در پژوهش هاي ژنومي حيوانات اهلي تهيه نقشه هاي ژنومي جامعي است که بتواند شناسايي جايگاه هاي موثر بر صفات مهم اقتصادي را امکان پذير سازد. انتظار مي رود که شناسايي چنين جايگاههايي منجر به طراحي برنامه هاي کارآمد اصلاح نژادي، خصوصاً انتخاب به کمک نشانگر (MAS) و در نتيجه افزايش صحت و پيشرفت انتخاب در حيوانات مزرعهاي شود. هدف مطالعه حاضر مكان يابي فيزيكي مقايسه اي كلون هاي BAC گاوي حاوي ژن هاي باروري فاکتور رشد تمايز يافته 9 (GDF9)، پروتئين ريخت زاي استخوان 15 (BMP15) و گيرنده نوع يك آن (BMPR1B) با استفاده از تكنيك هيبريد سازي در محل فلورسنتي (FISH) براي اولين بار روي كروموزوم هاي R- باندينگ گاو (BTA, 2n=60)، گاو ميش رودخانه اي (BBU, 2n=50)، گوسفند (OAR, 2n=54) و بز (CHI, 2n=60) با توجه به استاندارد ISCNDB 2000 بوده است. براي تهيه كروموزوم هاي R- باند شده با وضوح زياد، نمونه هاي خون كامل از گونه هاي مورد مطالعه با وارد سازي دير هنگام BrdU و Hoechst33258 كشت شدند. كلون هاي BAC حاوي ژن هاي مورد نظر از روي آخرين سازه ژنوم گاوي با توجه به گردآوري هاي توالي ژنوم گاوي UMD_3.1 و Btau_4.6.1 شناسايي شده و سپس از كتابخانه BAC گاوي موسسه INRA تهيه شدند. پس از کشت کلون ها، استخراج DNA و نشاندار سازي آن با روش Nick translation، اسلايدهاي متافازي در حضور COT-l DNA گاوي به مدت يک شب تحت تيمار FISH قرار گرفتند. مراحل رديابي سيگنال هاي FITC و تهيه متافازهاي RBPI- باندينگ به ترتيب با استفاده از سيستم آنتي بادي هاي FITC-avidin و anti-avidin و رنگ آميزي اسلايدها با پروپيديوم آيودايد انجام شد. تجزيه و تحليل FISH موقعيت دقيق فيزيكي و باندهاي كروموزومي مربوط به ژن هاي مورد مطالعه را روي متافازهاي گاو، گاوميش رودخانه اي، گوسفند و بز نشان داد. جايگاه دقيق فيزيكي ژن BMPR1B در گاو، گوسفند و بز يكسان بود (BTA/OAR/CHI6q15). در گاوميش رودخانه اي، ژن BMPR1B روي موقعيت BBU7q21 مكان يابي شد. ژن BMP15 در گاو و گاوميش رودخانه به ترتيب روي BTAXq31 و BBUXq36 و در موقعيت همولوگ (OAR/CHIXq24) در گوسفند و بز مكان يابي شد. براي جايگاه GDF9، موقعيت هاي كروموزومي BTA7q22.3، BBU9q24، OAR5q22.3 و CHI7q22.3 به ترتيب براي گاو، گاوميش رودخانه اي، گوسفند و بز شناسايي شدند. داده هاي حاصل شده از مطالعه حاضر علاوه بر توسعه نقشه هاي سيتوژنتيك گونه هاي مطالعه شده باعث توسعه اتصال نقشه هاي ژنتيكي روي باندهاي اختصاصي كروموزومي شده و همچنين مي تواند براي مطالعات ساختاري و عملكردي دقيق تر ژن هاي اخير مخصوصاً در گاوسانان مورد استفاده قرار گيرد. انتظار مي رود كه علاوه بر رديابي دقيق موقعيت مکاني ژن ها روي کروموزوم ها، بتوان هر چه بيشتر از تکنيک هاي مبتني بر سيتوژنتيک مولکولي در مطالعات مرتبط به شناسايي نواقص کروموزومي و امکان ارتباط آن ها با صفات اقتصادي، خصوصاً صفات توليد مثلي در دام هاي اهلي استفاده نمود. قابل ذکر است که شناسايي موقعيت مکاني ژن ها روي کروموزوم ها، منجر به اين خواهد شد که رديابي QTLها در حوالي اين ژن ها هر چه سريع تر و با هزينه کمتر گيرد.
كلمات كليدي: BMPR1B، BMP15، GDF9، نقشه يابي با FISH، كلون هاي BAC، گاو، گاوميش رودخانه، گوسفند، بز.
فهرست مطالب
فصل اول1
مقدمه و کليات1
1-1 مقدمه2
1-1-1 گاو4
1-1-2 گاوميش رودخانه اي4
1-1-3 گوسفند5
1-1-4 بز6
1-1-5 اهداف7
1-2 كليات7
1-2-1 تاريخچه مطالعات سيتوژنتيك در دامپروري7
1-2-2 منطق نقشه يابي ژن ها روي كروموزوم8
1-2-3 نقشه هاي لينكاژي9
1-2-4 نقشه هاي فيزيكي9
1-2-5 نقشه يابي مقايسه اي و اصلاح دام10
1-2-6 همولوژي11
1-2-7 کشت سلول هاي خوني11
1-2-7-1 تاريخچه11
1-2-7-2 اصول بنيادي12
1-2-8 تکنيک هاي باندينگ (رنگ آميزي) كروموزوم ها12
1-2-8-1 تاريخچه12
1-2-8-2 اصول پايه اي13
1-2-9- هيبريداسيون در محل فلورسنتي (FISH)15
1-2-9-1 تاريخچه15
1-2-9-2 اصول بنيادي15
1-2-9-3 استفاده از FISH در پژوهش هاي ستوژنتيک حيوانات اهلي16
1-2-9-4 استفاده از مكان يابي فيزيكي ژن ها با تكنيك FISH براي تاييد صحت گردآوري هاي ژنوم موجودات17
1-2-9-5 استفاده از مكان يابي فيزيكي ژن ها با تكنيك FISH براي اتصال نقشه هاي لينكاژي و RH روي كروموزوم ها19
1-2-9-6 استفاده از مكان يابي فيزيكي ژن ها با تكنيك FISH در رهيافت كلونينگ موقعيتي ژن ها و QTLها20
1-2-10 انواع پروب هاي کلون DNA ژنومي استفاده شده در FISH21
1-2-11 ايمونوفلوروسنس21
1-2-12 ويژگي هاي متافاز ها و نقشه هاي سيتوژنتيك خانواده گاو سانان22
1-2-12-1 آتوزوم ها و نقشه هاي سيتوژنتيك22
1-2-12-2 كروموزوم هاي جنسي26
1-2-13 بررسي ژن هاي BMPR1B، BMP15 و GDF927
1-2-13-1 ژن برولا (FecB)27
1-2-13-2 ژن GDF9 (FecGH)28
1-2-13-3 ژن BMP15 (FecX)29
1-2-13-4 اثر متقابل بين جهش هاي موثر بر باروري30
فصل دوم32
بررسي منابع32
2-1 سابقه مطالعات سيتوژنتيک و نقشه يابي ژن ها با تكنيك FISH در حيوانات مزرعه اي33
2-2 سابقه مطالعه ژن هاي BMPR1B، BMP15 و GDF9 در حيوانات مزرعه اي37
فصل سوم40
مواد و روش ها40
3- مواد و روش ها41
3 – 1 تهيه نمونه هاي خون و کشت سلول هاي خوني41
3 – 1- 1 تهيه ي نمونه هاي خون41
3 – 1- 2 کشت سلول هاي خوني با روش RB و انتخاب اسلايد هاي مناسب براي FISH41
3-2 انتخاب و سفارش كلون هاي BAC42
3-2-1 شناسايي كلون هاي BAC حاوي ژن هاي BMPR1B، BMP15 و GDF944
3-2-1-1 ژن BMPR1B45
3-2-1-2 ژن BMP1546
3-2-1-3 ژن GDF947
3-3 كشت باكتري هاي حاوي كلون هاي BAC و استخراج DNA48
3-4 نشاندارسازي DNA استخراج شده از كلون هاي BAC51
3-5 تهيه كاريوتايپ گاو، گاوميش رودخانه اي، گوسفند و بز51
3-6 هيبريداسيون در محل فلورسنتي (FISH)51
3-7 مراحل بعد از FISH52
3-7-1 آشكار سازي سيگنال هاي FITC53
3-7-2 RBPI- باندينگ53
3-8 بررسي ميكروسكوپي اسلايدها و رديابي سيگنال هاي FITC53
3-9 تعيين محل دقيق (باند كروموزومي) ژن هاي مورد مطالعه روي كروموزوم ها54
فصل چهارم55
نتايج55
4- نتايج56
4-1 كيفيت DNA استخراج شده از كلون هاي BAC56
4-2 نتايج حاصل از كشت سلولي و كاريوتايپ هاي تهيه شده براي گاو، گاو ميش رودخانه اي، گوسفند و بز با روش RBA- باندينگ56
4-2-1 كاريوتايپ RBA- باندينگ گاو (BTA)56
4-2-2 كاريوتايپ RBA- باندينگ گاو ميش رودخانه اي (BBU)56
4-2-3 كاريوتايپ RBA- باندينگ گوسفند (OAR)56
4-2-4 كاريوتايپ RBA- باندينگ بز (CHI)57
4-3 جايگاه فيزيكي ژن هاي BMPR1B، BMP15 و GDF9 با استفاده از تكنيك FISH روي كروموزوم هاي RBPI- باندينگ گونه هاي مورد مطالعه57
4-3-1 جايگاه فيزيكي ژن هاي BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گاو (BTA)57
4-3-2 جايگاه فيزيكي ژن هاي BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گاو ميش رودخانه اي (BBU)57
4-3-3 جايگاه فيزيكي ژن هاي BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گوسفند (OAR)57
4-3-4 جايگاه فيزيكي ژن هاي BMPR1B، BMP15 و GDF9 در بز (CHI)58
4-4 مقايسه جايگاه فيزيكي ژن هاي BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گاو، گاو ميش رودخانه اي، گوسفند و بز با انسان58
فصل پنجم96
بحث و نتيجه گيري96
5- بحث97
5-1 نقشه هاي ژنتيکي97
5-2 تفاوت هاي نقشه هاي فيزيكي و لينكاژي98
5-3 ژنوميکس مقايسه اي99
5-4 نتيجه گيري نهايي103
5-5 پيشنهادات103
واژه نامه104
منابع و مآخذ106
Abstract121
فهرست جداول
جدول 3-1. مواد استفاده شده در كشت سلول هاي لنفوسيت خون در پژوهش حاضر43
جدول 3-2. مشخصات كتابخانه BAC ژنوم گاوي موسسه INRA فرانسه44
جدول 3-3. مشخصات كامل كلون هاي BAC استفاده شده در پژوهش حاضر44
جدول 3-4. تركيبات محلول هاي P1، P2 و P3 استفاده شده در استخراج DNA50
جدول 4-1. جايگاه هاي ژني نقشه يابي شده، کلون هاي BAC شناسايي شده00000000000000000000000000000
فهرست شکل ها
شکل 2-1. مقايسه ايمونوفلوروسنس مستقيم و غير مستقيم22
شکل 3-1. اطلاعات كلون BtINRA-152G11استفاده شده به عنوان پروب در مكان يابي ژن BMPR1B..45
شکل 3-2. اطلاعات كلون BtINRA-745D07 استفاده شده به عنوان پروب در مكان يابي ژن BMPR1B.46
شکل 3-3. اطلاعات كلون BtINRA-320H10 استفاده شده به عنوان پروب در مكان يابي ژن BMP15.47
شکل 3-4. اطلاعات كلون BtINRA-748C10 استفاده شده به عنوان پروب در مكان يابي ژن BMP15.48
شکل 3-5. اطلاعات كلون BtINRA-544F11 استفاده شده به عنوان پروب در مكان يابي ژن GDF9.49
شکل 3-6. اطلاعات كلون BtINRA-444D9 استفاده شده به عنوان پروب در مكان يابي ژن GDF950
شکل 3-7. مراحل نشاندار سازي DNA با روش Nick Translation52
شکل 4-1. نتايج حاصل از استخراج DNA از كلون هاي BAC استفاده شده در پژوهش حاضر60
شکل 4-2. كاريوتايپ RBA- باندينگ تهيه شده براي گاو (BTA) در پژوهش حاضر61
شکل 4-3. آيديوگرام هاي G- باندينگ (چپ) و R- باندينگ (راست) گاو62
شکل 4-4. كاريوتايپ RBA- باندينگ تهيه شده براي گاوميش رودخانه اي (BBU) در پژوهش حاضر63
شکل 4-5. آيديوگرام هاي G- باندينگ (چپ) و R- باندينگ (راست) گاو ميش رودخانه اي64
شکل 4-6. كاريوتايپ RBA- باندينگ تهيه شده براي گوسفند (OAR) در پژوهش حاضر65
شکل 4-7. آيديوگرام هاي G- باندينگ (چپ) و R- باندينگ (راست) گوسفند66
شکل 4-8. كاريوتايپ RBA- باندينگ تهيه شده براي بز (CHI) در پژوهش حاضر67
شکل 4-9. جزئيات سيگنال هاي مربوط به نقشه يابي فيزيکي ژن BMPR1B با استفاده از تکنيک FISH و کلون BAC روي کروموزوم هاي RBPI-باندينگ در گاو (BTA).68
شکل 4-10. موقعيت دقيق کروموزومي ژن BMPR1B روي كروموزوم شماره 6 گاو (BTA)69
شکل 4-11. جزئيات سيگنال هاي مربوط به نقشه يابي فيزيکي ژن BMP15 با استفاده از تکنيک FISH و کلون BAC روي کروموزوم هاي RBPI-باندينگ در گاو (BTA).70
شکل 4-12. موقعيت دقيق کروموزومي ژن BMP15 روي كروموزوم X گاو (BTA)71
شکل 4-13. جزئيات سيگنال هاي مربوط به نقشه يابي فيزيکي ژن GDF9 با استفاده از تکنيک FISH و کلون BAC روي کروموزوم هاي RBPI-باندينگ در گاو (BTA).72
شکل 4-14. موقعيت دقيق کروموزومي ژن GDF9 روي كروموزوم شماره 7 گاو (BTA)73
شکل 4-15. جزئيات سيگنال هاي مربوط به نقشه يابي فيزيکي ژن BMPR1B با استفاده از تکنيک FISH و کلون BAC روي کروموزوم هاي RBPI-باندينگ در گاوميش رودخانه اي (BBU).74
شکل 4-16. موقعيت دقيق کروموزومي ژن BMPR1B روي كروموزوم شماره 7 گاو ميش رودخانه اي (BBU)75
شکل 4-17. جزئيات سيگنال هاي مربوط به نقشه يابي فيزيکي ژن BMP15 با استفاده از تکنيک FISH و کلون BAC روي کروموزوم هاي RBPI-باندينگ در گاوميش (BBU).76
شکل 4-18. موقعيت دقيق کروموزومي ژن BMP15 روي كروموزوم X گاو ميش رودخانه اي (BBU)77
شکل 4-19. جزئيات سيگنال هاي مربوط به نقشه يابي فيزيکي ژن GDF9 با استفاده از تکنيک FISH و کلون BAC روي کروموزوم هاي RBPI-باندينگ در گاوميش (BBU).78
شکل 4-20. موقعيت دقيق کروموزومي ژن GDF9 روي كروموزوم شماره 9 گاو ميش رودخانه اي (BBU)79
شکل 4-21. جزئيات سيگنال هاي مربوط به نقشه يابي فيزيکي ژن BMPR1B با استفاده از تکنيک FISH و کلون BAC روي کروموزوم هاي RBPI-باندينگ در گوسفند (OAR).80
شکل 4-22. موقعيت دقيق کروموزومي ژن BMPR1B روي كروموزوم شماره 6 گوسفند (OAR)81
شکل 4-23. جزئيات سيگنال هاي مربوط به نقشه يابي فيزيکي ژن BMP15 با استفاده از تکنيک FISH و کلون BAC روي کروموزوم هاي RBPI-باندينگ در گوسفند (OAR).82
شکل 4-24. موقعيت دقيق کروموزومي ژن BMP15 روي كروموزوم X گوسفند (OAR)83
شکل 4-25. جزئيات سيگنال هاي مربوط به نقشه يابي فيزيکي ژن GDF9 با استفاده از تکنيک FISH و کلون BAC روي کروموزوم هاي RBPI-باندينگ در گوسفند (OAR).84
شکل 4-26. موقعيت دقيق کروموزومي ژن GDF9 روي كروموزوم شماره 5 گوسفند (OAR)85
شکل 4-27. جزئيات سيگنال هاي مربوط به نقشه يابي فيزيکي ژن BMPR1B با استفاده از تکنيک FISH و کلون BAC روي کروموزوم هاي RBPI-باندينگ در بز (CHI).86
شکل 4-28. موقعيت دقيق کروموزومي ژن BMPR1B روي كروموزوم شماره 6 بز (CHI)87
شکل 4-29. جزئيات سيگنال هاي مربوط به نقشه يابي فيزيکي ژن BMP15 با استفاده از تکنيک FISH و کلون BAC روي کروموزوم هاي RBPI-باندينگ در بز (CHI).88
شکل 4-30. موقعيت دقيق کروموزومي ژن BMP15 روي كروموزوم شماره X بز (CHI)89
شکل 4-31. جزئيات سيگنال هاي مربوط به نقشه يابي فيزيکي ژن GDF9 با استفاده از تکنيک FISH و کلون BAC روي کروموزوم هاي RBPI-باندينگ در بز (CHI).90
شکل 4-32. موقعيت دقيق کروموزومي ژن GDF9 روي كروموزوم شماره 7 بز (CHI)91
شکل 4-33. جزئيات سيگنال هاي مربوط به نقشه يابي فيزيکي ژن هاي BMPR1B، BMP15 و GDF9 با استفاده از تکنيک FISH و کلون BAC روي کروموزوم هاي RBPI-باندينگ در گاو (BTA)، گاوميش رودخانه اي (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI).92
شکل 4-34. جايگاه فيزيکي ژن BMPR1B روي کروموزوم هاي R-باندينگ در گاو (BTA)، گاوميش رودخانه اي (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI) و مقايسه آن با انسان (HSA).93
شکل 4-35. جايگاه فيزيکي ژن BMP15 روي کروموزوم هاي R-باندينگ در گاو (BTA)، گاوميش رودخانه اي (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI) و مقايسه آن با انسان (HSA).94
شکل 4-36. جايگاه فيزيکي ژن GDF9 روي کروموزوم هاي R-باندينگ در گاو (BTA)، گاوميش رودخانه اي (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI) و مقايسه آن با انسان (HSA).95
فصل اول
مقدمه و کليات
1-1 مقدمه
هدف اصلي در پژوهش هاي ژنومي حيوانات اهلي تهيه نقشه هاي ژنومي جامعي است که بتواند شناسايي جايگاه هاي موثر بر صفات مهم اقتصادي را امکان پذير سازد. انتظار مي رود که شناسايي چنين جايگاههايي منجر به طراحي برنامه هاي کارآمد اصلاح نژادي، خصوصاً انتخاب به کمک نشانگر (MAS) و در نتيجه افزايش صحت و پيشرفت انتخاب در حيوانات مزرعهاي شود. اگر چه نقشه هاي ژنتيکي که تا کنون براي حيوانات اهلي تهيه شدهاند براي رديابي ژن ها و جايگاه هاي صفات کمي در فواصل 10-5 سانتي مورگان (cM) و شروع برنامه هاي MAS کفايت مي کنند، اما شناسايي دقيق جايگاه فيزيکي ژن ها و سپس كلونينگ و رديابي واريانس هاي ژنتيکي آن ها و در گام بعدي مطالعه ارتباط اين واريانس ها با صفات اقتصادي در اکثر موارد به ويژه در نژادهاي موجود در کشورهاي در حال توسعه از جمله ايران، به پژوهش هاي بيشتري نياز دارند. به کارگيري داده هاي ژنوتيپي در ارزيابي هاي ژنتيکي تجاري و استراتژي هاي انتخاب بهينه، از جمله چالش هاي اصلاح نژادي مي باشند که قطعاً نيازمند پيشرفت هاي بيشتري هستند.
كاربرد سيتوژنتيك در دام هاي اهلي از تكنولوژهاي مفيد براي توسعه ژنتيكي دام هاي اهلي است. سيتوژنتيك مي تواند براي انتخاب حيوانات مولد فاقد نواقص كروموزومي مسئول نواقص فيزيكي (آنيوپلوئيدي)، باروري كمتر (نواقص بالانس كروموزومي) يا ناباروري (نواقص كروموزوم هاي جنسي) استفاده شود. همچنين سيتوژنتيك مي تواند براي بررسي آلودگي هاي محيطي با مطالعه حيوانات موجود در مناطق آلوده و استفاده از آن ها به عنوان شناساگرهاي بيولوژيكي استفاده شود (يانوزي، 2007).
مك كوسيك (1980) پيشنهاد داد كه ژنوم را به عنوان بخشي از آناتومي بايد مورد توجه قرار داد. آناتومي ژنوم هم از نگاه ساختاري و هم از نگاه عملكردي براي موجودات بسيار مهم است. آناليز ژنوم گونه هاي اهلي ما را قادر به شناسايي و فهم مكانيسم كنترل ژنتيكي صفات مهم اقتصادي مي كند. نقشه يابي ژن ها قدم اول در آناليز ژنوم موجودات است. با در دسترس قرار گرفتن نقشه هاي دقيق كروموزومي و توالي هاي DNA، يك پژوهشگر مي تواند در اكثر موارد با جستجو در بانك داده هاي نقشه يابي، روي يك ناحيه كانديد در ژن مورد نظر خود تمركز كند تا اينكه ساعت ها تا ماه ها زمان را صرف فعاليت هاي آزمايشگاهي وقت گير كند. با توجه به اشتباهات موجود در نقشه هاي لينكاژي و همچنين گردآوري هاي توالي ژنومي حيوانات، بهترين روش براي كاهش اشتباهات نقشه يابي ژنها استفاده همزمان از اطلاعات نقشه ها و توالي يابي براي تاييد ترتيب ژني در جايگاه هاي مورد نظر است (ويلسون و همکاران، 2001).
نقشه يابي مقايسه اي امكان دست يابي به حجم زيادي از اطلاعات را در نتيجه برنامه هاي ژنومي انسان فراهم آورده است. نقشه يابي ژن هاي انسان پايه و اساس كلونينگ موقعيتي- مقايسه اي ژن هاي كانديد براي جايگاه هاي صفات است. نقشه هاي مقايسه اي بر اساس نقشه يابي لوكوس هاي حفظ شده در حيوانات مختلف قرار دارد. نقشه يابي لينكاژي نمي تواند كمك زيادي به نقشه يابي مقايسه اي بكند زيرا جايگاه هاي حفظ شده اغلب به دليل فقدان تنوع آللي تابع نقشه يابي ژنتيكي نيستند. بنابراين نقشه يابي مقايسه اي عمدتاً بر پايه مكان يابي فيزيكي ژن ها و نشانگرها استوار است (فرايز و رووينسکي، 1999).
پژوهش هاي سيتوژنتيك و تجزيه و تحليل هاي كروموزومي در حيوانات مزرعه از نظر اقتصادي بسيار حائز اهميت است. بنابراين تمامي حيوانات مزرعه خصوصاً آن دسته از حيواناتي كه از تلقيح مصنوعي استفاده مي كنند به دليل امكان پخش سريع نواقص كروموزومي در گله، بايد تحت كنترل هاي سيتوژنتيك نگهداري شوند.
به عنوان مثال در كشور ايتاليا حدود 25 درصد از مشكلات توليد مثلي جمعيت گاوميش هاي ماده در اثر نواقص كروموزومي است كه به هيچ عنوان در فنوتيپ نمود پيدا نمي كنند و به طور مخفي باعث زيان اقتصادي مي شوند. اين نقايص تنها از طريق بررسي هاي سيتوژنتيك و تهيه كاريوتايپ حيوانات قابل شناسايي هستند (يانوزي و همکاران، 2003). شناسايي زود هنگام نواقص كروموزومي از طريق بررسي كاريوتايپ حيوانات مولد مي تواند منجر به حذف زود هنگام آن ها از گله و در نتيجه صرفه جويي در وقت و هزينه هاي صرف شده شود. از نواقص كروموزومي كه منجر به بروز مشكلات توليد مثلي و آسيب رساندن به صنعت دامپروري خواهند شد مي توان به نواقص كروموزوم جنسي از قبيل مونوسومي كروموزوم X، تريسومي كروموزوم X، سندرم جنسيت معكوس و فري مارتينيسم اشاره نمود كه در همه موارد حيوانات حامل اين نواقص به دليل آسيب هاي موجود در اندام هاي داخلي جنسي نابارور هستند (يانوزي، 2007).
اهميت جهاني توليدات دامي زمينه ساز تلاش هاي قابل توجهي براي رد يابي ژن هاي کنترل کننده واريانس هاي صفات مهم اقتصادي شده است. رديابي اين گونه واريانس ها به طور عمده اي با در دسترس بودن نشانگرهاي مولکولي مرتب شده در طول کروموزوم ها آسان خواهد شد. در دهه هاي اخير چندين نقشه ژنومي براي حيوانات اهلي تهيه شدهاند که اکثراً بر اساس نقشه هاي لينکاژي هستند که در تهيه آن ها فقط نشانگرهاي چند شکل را مي توان در نظر گرفت. در حاليکه نقشه هاي فيزيکي تهيه شده با روش هاي FISH و RH را مي توان با استفاده از توالي هاي مونومورف نيز تهيه نمود. بنابراين نقشه هاي FISH و RH نسبت به نقشه هاي لينکاژي حاوي ژن هاي کد شونده بيشتري هستند که باعث تسهيل نقشه يابي مقايسه اي بين گونه ها و همچنين کمک به شناسايي بهتر و دقيق تر QTLهاي موجود در اطراف اين ژن ها مي شوند (جان و همکاران، 2006).
اقتصاد غذايي جهان به طور فزاينده اي به توليدات دامي وابسته است. طي دهه هاي اخير در كشورهاي در حال توسعه آسيايي كه در آن ها غالباً انفجار جمعيت رخ داده است ميزان مصرف گوشت، 4 درصد در هر سال و شير و لبنيات، 3-2 درصد در هر سال افزايش يافته است (فائو، 2012). در سال 2050 جمعيت جهان حدود 15/9 ميليارد نفر تخمين زده شده است. همچنين تخمين زده مي شود كه مقدار مصرف مرغ و ساير توليدات دامي به ترتيب 3/2 و 8/1-4/1 برابر سال 2010 خواهد شد. البته سهم بيشتر اين افزايش مصرف شامل كشورهاي در حال توسعه خواهد بود (فائو، 2011). بنابراين چالش 50 سال آينده افزايش محصولات دامي براي رفع نيازهاي جهان است.
حيوانات اهلي طيف وسيعي از نژادهاي اهلي شده پستانداران و پرندگان را شامل مي شوند كه سهم عمده اي را در تامين معيشت جوامع انساني و همچنين اقتصاد كشاورزي اكثر كشورهاي جهان بر عهده دارند. دام ها غذا، سوخت و جابجايي را فراهم مي آورند، در امنيت غذايي نقش دارند، توليد محصولات زراعي را افزايش مي دهند، سبب توليد نقدينگي براي روستائيان شده و اشتغال ايجاد مي كنند (فائو، 2007). به جرات مي توان گفت كه در توليد حيوانات مزرعه اي مهم ترين فاكتور توانايي توليد مثل آن هاست. گاوي كه به ندرت يك گوساله زنده يا سالم توليد مي كند ارزش نگهداري را ندارد.
1-1-1 گاو
در ميان حيوانات اهلي گاو و گاوميش به دليل جثه درشت و تنوع و ارزش زياد محصولات توليد شده توسط آن ها داراي اهميت زيادي هستند، به طوريكه در بيشتر فرهنگ ها به عنوان دارايي هاي عمده به حساب مي آيند (فائو، 2007). به نظر مي رسد که همه نژادهاي حال حاضر گاو از نژاد منقرض شده ي Aurochs (Bos primigenins) اهلي شده اند. شواهد DNA ميتوکندريايي نشان مي دهند که دو طبقه بندي گاو اهلي يعني Bos Indicus (زبو) و Bos taurus (گاو اروپايي) حدود صد هزار سال پيش انشقاق يافته اند (لوفتوس و همکاران، 1994 و بيلي، 1996) و حدود ده هزار سال پيش به صورت مجزا اهلي شده اند (گريگسون، 1980 و لوفتوس و همکاران، 1994). منطقه مهرگراره (Mehrgrarh) در پاکستان امروزي کانديداي قوي اهلي شدن گاو Bos indicus است و منطقه کاتال هيوک (Catal Huyuk) در آناتولي يا همان ترکيه امروزي نيز احتمالاً محل اهلي شدن گاو Bos Taurus مي باشد. گاو از قديم الايام نقش مرکزي در سير تکاملي فرهنگ انسان در همه قاره ها به جز نواحي قطبي داشته است. از ديدگاه اقتصادي گاو مهمترين گونه حيواني است كه تاكنون اهلي شده است (کانينگهام، 1992). در نقاط مختلف دنيا، گاو نيروي کار، شير و گوشت توليد مي کند. توليد جهاني گوشت قرمز، گوشت سفيد گوساله، شير خشک بدون چربي، کره و پنير در سال 2004 به ترتيب 51، 191، 3486، 96676، 13373 هزار تن تخمين زده شده است (يو اس دي اي، 2005).
1-1-2 گاوميش رودخانه اي
اين حيوان حدود 5000 سال پيش در هندوستان اهلي شده است (کيرستين و همکاران، 2005). گاو ميش رودخانه اي اهلي (Babalus Babalis) متعلق به باويده، زير خانواده بوينه، جنس بوباليس، و گونه آرني يا گاوميش وحشي هندي است (http://www.buffalopedia.cirb.res.in). حدود 168 ميليون راس گاوميش آبي در جهان وجود دارد كه 161 ميليون راس آن در آسيا قرار گرفته اند (داهانا، 2004 و بورقس و مازي، 2005). اگر چه تعداد جهاني گاوميش نسبت به گاو 9/1 است اما تعداد انسان هاي بيشتري در جهان (عمدتاً ساكنين آسياي جنوب شرقي) به گاوميش بيشتر از ساير دام هاي اهلي وابسته اند (فائو، 2000). بنابراين گاوميش داراي اهميت اقتصادي بسيار زيادي در جهان است. علاوه بر اين بر خلاف ساير گاوسانان اهلي، تعداد گاوميش رودخانه اي در 20 سال گذشته (قبل از 2009) با نرخ متوسط 2+ درصد در هر سال در جهان افزايش يافته است. بيشترين نرخ افزايش در اروپا (5/4+ درصد)، هندوستان (3/5+ درصد) و پاكستان (8/4+ درصد) اتفاق افتاده است (51). رشد زياد سالانه گاوميش در مقايسه با ساير گونه هاي اهلي سبب افزايش علاقه دانشمندان و پرورش دهندگان به اين حيوان شده است. نژاد مديترانه اي گاو ميش رودخانه اي را مي توان عمدتاً در ايتاليا، مصر، ايران، تركيه، روماني، عراق، بلغارستان، سوريه و يونان مشاهده نمود. گاو ميش رودخانه اي با اهداف توليد گوشت و شير پرورش داده مي شود. در اكثر كشورها 50 درصد شير توليدي اين حيوان صرف نوشيدن مي شود و در برخي كشورها از جمله ايتاليا عمدتاً از شير گاوميش رودخانه اي براي تهيه پنير ماسرلا (Mozzerella) استفاده مي شود. درصد پروتئين و چربي شير گاوميش رودخانه اي بين نژادهاي مختلف به ترتيب حدود 6/4-2/4 و 5/8-0/6 درصد مي باشد. بيشترين مقدار توليد شير نژاد مديترانه گاوميش رودخانه اي اي 2800-1500 كيلوگرم در هر دوره شيردهي ثبت شده است (مويلي و بورقس، 2005). كلسترول گوشت گاوميش كمتر از (3/1) گوشت گاو بوده و لذا براي جيره هاي كم كلسترول توصيه مي شود (کوکت و کل، 2009). گاوميش آبي (Water Buffalo) به دو زير گونه گاوميش رودخانه اي و گاو ميش باتلاق تقسيم بندي مي شود. از نظر ظاهري گاوميش رودخانه اي نسبت به گاوميش باتلاق بزرگتر، داراي شاخ تاب خورده تر و متمايل به غلتيدن در آب هاي تميز و رودخانه ها است (http://www.buffalopedia.cirb.res.in).
1-1-3 گوسفند
نشخوار كنندگان كوچك (گوسفند و بز) به دليل جثه كوچكتر و قيمت كمتر شايد نسبت به گاو و گاوميش كم اهميت تر به نظر برسند. اما به دليل تعداد و پراكندگي زياد و توليد مثل بيشتر و سريعتر از توجه عمومي بيشتري برخوردار هستند (فائو، 2007). نشخوار كنندگان كوچك داراي نيازمندي هاي غذايي و سرمايه كمتري نسبت به گونه هاي بزرگتر هستند كه اين ويژگي آن ها را براي توليد كنندگان در مقياس كوچك مطلوب ساخته است (کسگي و اکيو، 2007). آن ها همچنين داراي فاصله نسلي كوتاه تر، باروري بيشتر، توانايي بهتر براي استفاده از طيف وسيعي از غذاهاي دامي از جمله باقي مانده هاي محصولات كشاورزي كم ارزش هستند (هولست، 1999). اولين بار گوسفند در فسيل هاي 5/2 ميليون سال پيش مشاهده شد (مايجالا، 1997) که در ظاهر بزرگ تر از گوسفندان امروزي بود است. احتمالا گوسفند اهلي امروزين وگوسفندان موفلون اروپايي از يک جد مشترک مشتق شده اند (هيندلدر و همکاران، 1998). اهلي شدن گوسفند نه هزار سال قبل از ميلاد مسيح در جنوب غربي آسيا شروع شده و چهار هزار سال پيش با مهاجرت به سمت غرب از ميان آسيا و اروپا به سمت اقيانوس اطلس خاتمه يافت است (هيندلدر و همکاران، 1998). در ابتدا گوسفند براي گوشت، پوست و استخوان ها مورد جستجو قرار مي گرفت ولي بعد از اهلي شدن، توليدات ديگري نظير پشم و شير نيز اهميت پيدا کردند. تعداد گوسفندان اهلي شده (Ovis aries, 2n=54) در دنيا به طور پيوسته در حال افزايش است. در سال 2009 حدود 3/1 ميليارد راس گوسفند در جهان به وسيله فائو گزارش شد. تعداد زياد گوسفندان را مي توان در چين، استراليا، هند، ايران، سودان و نيوزيلند مشاهده نمود (فائو، 2007). محصولات گوسفندي (گوشت، شير، پشم، چرم و کود) نقش مهمي را در اقتصاد کشاورزي کشورهاي جهان بازي مي کنند. در کشورهاي کمتر توسعه يافته و فقير، گوسفند تنها منبع اقتصادي بسياري از ساکنان روستاهاست. وجود بيش از 1400 نژاد شناخته شده، گوسفند را به يک مدل ايده آل براي مطالعات تنوع زيستي و ژنومي تبديل کرده است. در حال حاضر 60 نژاد گوسفند در حال انقراض و 120 نژاد ديگر نيز در معرض خطر انقراض قرار دارند (90). به دليل ارتباط فيلوژنيک نزديک بين انسان و گوسفند، از اين حيوان به عنوان مدل هاي زيست درماني استفاده مي شود. گوسفند يكي از مهمترين گونه هاي حيوان اهلي اصطلاحاً همه کاره براي بشر است كه براي توليد گوشت، شير و پشم استفاده ميشود و در کشورهاي فقير البته پوست خام و کود هم بايد به توليدات اين حيوان اضافه شود (گلدامر و همکاران، a2009).
1-1-4 بز
فائو جمعيت بزهاي جهان را در سال 2000 حدود 719 ميليون راس تخمين زده بود که نود و چهار درصد آن ها در کشورهاي در حال توسعه قرار دارند. بز منبع قابل اطميناني از پروتئين (گوشت و شير) و الياف را در كشورهاي در حال توسعه تامين ميكند و همچنين مهارت آن در خوردن طيف وسيعي از سبزيجات اين حيوان را در جايگاه مهمي در اقتصاد كشاورزي قرار داده است. از آنجايي که عموماً بز در سيستم هاي توليدي کم بازده با سطوح معيشتي پايين نگهداري مي شود، به کارگيري برنامه هاي تجاري اصلاح نژادي در چنين سيستم هايي با محدوديت هاي زيادي مواجه است مگر اينکه از تکنولوژي هاي نوين اصلاحي مانند تکنولوژي هاي استفاده شده در MAS براي بهبود اصلاحي اين حيوان استفاده شود. نقشه يابي هاي ژني در بز صرف نظر از برخي فعاليت ها در زمينه بزهاي شيري، از پيشرفت کمتري نسبت به ساير حيوانات مزرعه اي برخوردار هستند. مقاومت در برابر شرايط نامساعد محيطي نظير کم آبي، گرما، گرسنگي، مقاومت بيشتر به امراض و آفات نسبت به ساير دام ها، عدم نياز به مراتع مرغوب و با کيفيت خوب، مديريت آسان نسبت به گوسفند و گاو و مهم تر از همه زياد بودن نرخ دوقلوزايي و چند قلوزايي در بز نسبت به ساير نشخوار کنندگان، برخي از مزاياي پرورش اين حيوان هستند. در بز چهار قلوزايي، پنج قلوزايي و شش قلوزايي نيز مشاهده شده است. بز را مي توان حيوان خانواده هاي فقير نام گذاري کرد، زيرا علي رغم هزينه هاي نگهداري کم، داراي توانايي توليد شير کافي بوده (خالداري، 1387) و همچنين بزهاي ماده از دوران توليدي طولاني برخوردارند که در صورت سالم بودن توانايي زايش خود را تا اواخر سن هفت تا هشت سالگي حفظ مي کنند (گوپتا، 2008). از نظر رده بندي جانوري، بزها به جنس کاپرا، خانواده تهي شاخان، دسته نشخوارکنندگان، راسته سم داران، زير راسته زوج سمان، رده پستانداران، زير رده جفت داران و شاخه مهره داران تعلق دارند. شواهد فسيلي نشان داده اند که سويه هاي گوسفند و بز حدود پنج تا هشت ميليون سال پيش تفرق يافته اند. سويه کاپرين (Caprine) حدود هفده تا بيست ميليون سال پيش از گاوسانان (Bovidae) تفرق يافته است (مدوکس، 2005). به نظر مي رسد که اين حيوان تقريباً ده هزار سال پيش در کوه هاي زاگرس ايران اهلي شده است و تاکنون حدود دويست نژاد مختلف براي اين حيوان شناسايي شده اند. بيشتر بزها به صورت گله هاي مختلف اکثراً در مناطق گرمسيري و نيمه گرمسيري جهان پراکنده اند. مهم ترين توليدات بز عبارتند از شير، گوشت، کره، پنير، موهر و چرم. پنير مخصوص بز و چرم حاصل از پوست بزغاله هاي جوان، از جمله محصولات دامي گران قيمت به شمار مي روند. گوشت بز به دليل چربي و کلسترول کم با گوشت مرغ قابل مقايسه است. همچنين گوشت بز نسبت به گوشت مرغ از مواد معدني بيشتر و چربي کل و اشباع شده کمتري برخوردار است. شير بز را مي توان به راحتي با شير گاو جايگزين نمود (گوپتا، 2008). شناخت بز در سطح ژنومي نسبت به ساير دام هاي اهلي مثل گاو، گوسفند و خوك با تاخير انجام شده است. جديدترين نقشه هاي ژنتيك و سيتوژنتيك در بز بيش از يك دهه پيش منتشر شدند (ويمن و همکاران، 1996 و شيبلر و همکاران، 1998). فائو در سال 2005 جمعيت گاو و گاوميش ايران را به ترتيب 8/8 و 55/0 ميليون راس اعلام كرد. همچنين بنا به آمار فائو در سال 2008 ايران از نظر جمعيت گوسفند و بز به ترتيب در جهان داراي رتبه هاي چهارم (54 ميليون راس) و هفتم (5/26 ميليون راس) بوده است (فائو، 2011).
با وجود اهميت هاي ياد شده، جاي خالي پژوهش هاي سيتوژنتيک به ويژه مکان يابي فيزيکي ژن ها در حيوانات مزرعه اي در ايران به وضوح احساس مي شود. بنابراين ما با ارائه اين پژوهش مي کوشيم تا گام جديدي را در راه پيشرفت برنامه هاي اصلاح نژادي حيوانات مزرعه اي به خصوص گاو، گاوميش رودخانه اي، گوسفند و بز برداشته و دريچه جديدي از مطالعات ژنتيکي حيوانات مزرعه اي را براي پژوهشگران اصلاح نژادي کشورمان بگشائيم.
1-1-5 اهداف
اهداف پژوهش حاضر شامل موارد زير بوده است:
• مكان يابي ژن هاي BMPR1B، BMP15 و GDF9 روي كروموزوم هاي گاو، گاوميش رودخانه اي، گوسفند و بز براي اولين بار در دنيا.
• آماده سازي ساز وكارهاي لازم در زمينه نقشه يابي فيزيكي ژن ها به منظور تقويت برنامه هاي اصلاح نژادي در كشور.
• آماده سازي بستر لاز براي استفاده از غربالگري مبتني بر تكنيك هاي سيتوژنتيك در برنامه هاي اصلاح نژادي در كشور.
1-2 كليات
1-2-1 تاريخچه مطالعات سيتوژنتيك در دامپروري
كاربرد سيتوژنتيك در حيوانات اهلي با كشف ترانسلوكاسيون روبرتسوني بين BTA1 و BTA29 (rob1;29) در جمعيت گاوهاي سوئدي قرمز و سفيد در سال 1964 آغاز شد (گوستاوسون و راکمن، 1964). مطالعات بعدي وقوع 14-13 درصد ترانسلوکاسيون را در جمعيت مورد مطالعه نشان داد (گوستاوسون، 1969). بررسي ايشان روي داده هاي اصلاحي، ارتباط صريح هتروزايگوسيتي براي ترانسلوکاسيون 29/1 و 5-4 درصد کاهش در باروري اين نژاد را آشکار ساخت (گوستاوسون، 1980). نتايج اين پژوهش به وضوح نشان داد که نه تنها نواقص کروموزومي در حيوانات اهلي اتفاق مي افتد بلکه داراي اثرات فيزيولوژيک در حيوانات حامل و بنابراين داراي عواقب اقتصادي در صنعت دامپروري هستند.
از 1969 به بعد سيتوژنتيک حيوانات اهلي به طور گسترده در جنبه هاي کلينيکي، تکاملي، مولکولي، محيطي و توليد مثلي گسترش يافت. مطالعه کروموزوم هاي حيوانات اهلي عموماً بسيار دشوار است زيرا همه آتوزوم ها (گاو، بز و سگ) و اکثر آتوزوم ها (گوسفند و گاوميش رودخانه اي) و يا برخي از آنها (اسب، الاغ، خوک و خرگوش) آکروسانتريک با اندازه هاي نزديک به هم بوده و تفکيک آن ها با روش سنتي بسيار دشوار است. اين ويژگي پيشرفت سيتوژنتيک حيوانات را دچار اختلال کرده بود تا زماني که تکنيک هاي باندينگ کروموزومي در درجات مختلف فشردگي کروموزوم ها پايه گذاري شده (دي براردينو و همکاران، 1985؛ يانوزي، 1990 و يانوزي و همکاران، 1990) و در مطالعات مقايسه اي باندهاي كروموزومي بين گونه هاي مختلف براي شناسايي همولوژي ها و تفاوت هاي بين آن ها مورد استفاده قرار گرفتند. تکنيک هاي باندينگ کروموزومي امکان تحقق کاريوتايپ هاي واضح و غير مبهم را براي حيوانات اهلي فراهم آورد (فورد و همکاران، 1980؛ آي اس سي ان دي اي، 1990، تگزاس نامنکلاچر، 1996؛ آي ISCNH، 1997؛ CSKDP، 1998؛ ISCNDB، 2000 و هييز و همکاران، 2002). افزايش اطلاعات پژوهشگران از كروموزوم هاي حيوانات اهلي پايه و اساس دست يابي به يك استاندارد براي نامگذاري كروموزوم هاي گونه هاي مهم اهلي شد (ISCNDB، 2000). همچنين مشکلات مربوط به برخي کروموزوم ها مخصوصاً براي گاو و گوسفند اخيراً با استفاده از تکنيک هاي باندينگ و نشانگرهاي FISH رفع شده اند (هييز و همکاران، 2000).
علاوه بر اين، با در دسترس قرار گرفتن پروب هاي DNA و كاربرد تكنيك FISH، سيتوژنتيك حيوانات اهلي وارد عرصه جديدي شده است. به طوريكه علاوه بر فراهم آوردن امكان رديابي دقيق موقعيت مکاني ژن ها روي کروموزوم ها، در مطالعات مرتبط به شناسايي نواقص کروموزومي و امکان ارتباط آن ها با صفات اقتصادي، خصوصا صفات توليد مثلي در دام هاي اهلي نيز مورد استفاده قرار گرفته است. قابل ذکر است که شناسايي موقعيت مکاني ژن ها روي کروموزوم ها، منجر به اين خواهد شد که رديابي QTL در حوالي اين ژن ها هر چه سريع تر و با هزينه کمتر صورت پذيرد (يانوزي و دي براردينو، 2008).
امروزه مهم ترين كاربردهاي سيتوژنتيك در بهبود برنامه هاي ژنتيكي حيوانات اهلي شامل موارد زير است:
1- سيتوژنتيك كلينيكي: به مطالعه نواقص كروموزومي، فراواني و اثرات فنوتيپي آن ها بر حيوانات اهلي مي پردازد.
2- سيتوژنتيك تکاملي: به مطالعه شباهت هاي كروموزومي و يا واگرايي هاي كروموزومي بين گونه هاي مرتبط يا غير مرتبط مي پردازد.
3- سيتوژنتيك مولكولي: عبارت است از استفاده از نشانگرهاي مولكولي و تكنيك FISH براي مكان يابي فيزيكي ژن ها و توسعه نقشه هاي سيتوژنتيك حيوانات اهلي.
4- نظارت هاي محيطي (Environmental monitoring): عبارت است از كاربرد آزمون هاي سيتوژنتيك در جمعيت هاي حيواني به منظور بررسي اثر مضر مواد جهش زاي موجود در زنجيره غذايي و زيست محيطي آن ها (نيکولا، 2007).
1-2-2 منطق نقشه يابي ژن ها روي كروموزوم
تهيه نقشه هاي ژنتيكي در سيستم هاي حيواني به سال 1913 يعني زمان انتشار يك نقشه از كروموزوم X براي دروزوفيلا بر مي گردد (استوارت، 1913). نقشه ها براي شکستن مولفه هاي ژنتيکي و محيطي صفات پيچيده ضروري هستند. در نقشه هاي ژنتيکي، ژن ها و ترتيب آن ها روي هر کروموزوم شناسايي مي شوند (مولسانت و همکاران، 2001). براي تعيين ترتيب جايگاه هاي ژني روي کروموزوم ها و توسعه نقشه هاي ژني مي توان از چندين رهيافت استفاده کرد. با توجه به اينکه تمامي رهيافت هاي نقشه يابي ژن ها مستعد بروز خطاهاي حاصل از نواقص تکنيکي و يا عدم وجود برنامه آماري ويژه اي براي تمايز بين ترتيب هاي مختلف جايگاه ها هستند، توجه به اين نکته حائز اهميت است که صحت نقشه هاي ژنومي در صورت ترکيب اطلاعات منابع مختلف براي تهيه نقشه هاي کامل افزايش خواهد يافت. ژن ها را مي توان با روش ها و با دقت هاي متفاوتي نقشه يابي کرد. نقشه هاي لينکاژي و فيزيکي دو نوع از نقشه هاي ژنتيکي با کاربرد ها و مقياس هاي اندازه گيري مختص به خود هستند (جان و همکاران، 2006).
1-2-3 نقشه هاي لينكاژي
نقشه هاي لينكاژي ترتيب و فاصله نسبي ژن ها را بر اساس ميزان وقوع نوتركيبي بين آن ها تعيين مي كنند. بنابراين در تهيه آن ها فقط نشانگرهاي چند شکل را مي توان در نظر گرفت. از آنجائيكه نوتركيبي به راحتي قابل محاسبه نيست، معمولاً از يك روش آماري بر اساس حداكثر درست نمايي براي محاسبه آن استفاده مي شود كه در آن احتمال متصل بودن دو نشانگر در مقابل احتمال متصل نبودن آن ها مقايسه مي شود. مقياس آنرا LOD SCORE مي نامند. مقدار LOD SCORE بالاي سه نشان دهنده اتصال دو نشانگر است. بنابراين چون نقشه يابي لينكاژي بر پايه روش هاي آماري استوار است، نقشه هاي لينكاژي از اعتبار كافي براي نشان دادن ترتيب درست نشانگرها برخوردار نيستند (ويلسون و همکاران، 2001).
1-2-4 نقشه هاي فيزيكي
در روزهاي آغازين نقشه يابي كروموزومي مزاياي شناسايي جايگاه سيتوژنتيك (فيزيكي) يك لوكوس مشخص نبود. تصور مي شد كه اطلاعات پيوستگي ميوزي (لينكاژ) يا همان ارتباط نشانگرهاي ژنتيكي با صفات، به دليل اينكه اساس MAS هستند براي اهداف مختلف مطالعات ژنومي كفايت مي كنند. در حيوانات اهلي به دليل دشواري تهيه كاريوتايپ، كاربردهاي عمومي نقشه يابي كروموزومي تحت مجادله بود (فرايز و رووينسکي، 1999). نقشه هاي سيتوژنتيك نقشه هايي هستند كه نشانگرها را دقيقاً روي باندهاي اختصاصي كروموزوم ها مكان يابي مي كنند. پروب هاي استفاده شده براي تهيه نقشه هاي سيتوژنتيك معمولاً كلون هاي حاوي قطعات بزرگ ژنومي (ژن ها يا نشانگرهاي چند شكل) از قبيل YAC و BAC هستند. مكان يابي سيتوژنتيك پارامتر بسيار مهمي براي شناسايي ژن ها، جايگاه هاي مسئول بيماري ها و بازآرايي هاي كروموزومي هستند. انواع مختلفي از نقشههاي فيزيکي وجود دارند. اولين و کم وضوحترين نقشه فيزيکي، نقشه سيتوژنتيک است. نقشه سيتوژنتيک بر اساس الگوهاي باندينگ (رنگ آميزي) کروموزومها قرار دارد. اندازهگيري اين الگوها در ابتدا براي تعيين اندازه فيزيکي کروموزومهاي انسان به کار رفته و لذا منجر به جداسازي کروموزومها بر اساس اندازه از 1 تا 23 شد. امروزه با استفاده از سيتوباندها (به عنوان مثال 22q11) کار با نقشههاي فيزيکي راحتتر شده است (ميشل و گري، 2003). نقشه هاي فيزيکي را مي توان با سه روش FISH، نقشه هاي RHو نقشه هاي كنتيگ تهيه نمود (مونتگومري، 2000). طي پانزده سال اخير، تکنيک FISH در حيوانات اهلي عمدتاً در پژوهش هايي با اهداف شناسايي نواقص کروموزومي، نقشه يابي ژن ها، نقشه يابي مقايسه اي، شناسايي قطعات کروموزومي حفظ شده داراي ژن هاي يکسان در بين گونه ها و بررسي ويژگي هاي تکاملي کروموزوم ها به کار برده شده است (روبس و همکاران، 2009). نقشههاي فيزيکي كلون هاي همپوشان چهارچوب اصلي فعاليت هاي كلونينگ موقعيتي ژن ها را فراهم آورده اند. استفاده از FISH با نشانگرهاي مولکولي منافع بسيار زيادي را براي محققين سيتوژنتيک



قیمت: تومان


پاسخ دهید